การตรวจจับกรดนิวคลีอิกของไวรัส

ลำดับจีโนมของไวรัสส่วนใหญ่เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วโพรบกรดนิวคลีอิกซึ่งเป็นส่วนสั้นๆ ของ DNA ที่ออกแบบมาเพื่อผสมพันธุ์กับ DNA ของไวรัสหรือส่วนอาร์เอ็นเอที่เสริมกันปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นในการตรวจหาไวรัสวิธีการวินิจฉัยปริมาณงานสูงได้รับการพัฒนาเมื่อเร็วๆ นี้

ก. เทคนิคการผสมกรดนิวคลีอิก

การผสมพันธุ์ของกรดนิวคลีอิก ซึ่งรวมถึง Southern blotting (Southern) และ Northern blotting (Northern) เป็นเทคนิคใหม่ที่พัฒนาอย่างรวดเร็วในด้านการวินิจฉัยไวรัสเหตุผลของการสอบวิเคราะห์ไฮบริไดเซชันคือการใช้ส่วนสั้นๆ ของ DNA (เรียกว่า “โพรบ”) ที่ออกแบบมาเพื่อไฮบริไดซ์กับส่วน DNA ของไวรัสหรืออาร์เอ็นเอที่เสริมกันโดยการให้ความร้อนหรือการบำบัดด้วยอัลคาไลน์ DNA หรือ RNA เป้าหมายแบบสองเกลียวจะถูกแยกออกเป็นสายเดี่ยวและจากนั้นจะถูกตรึงบนตัวรองรับที่แข็งแรงหลังจากนั้น โพรบจะถูกเพิ่มและผสมพันธุ์กับ DNA หรือ RNA เป้าหมายเนื่องจากโพรบติดฉลากด้วยไอโซโทปหรือนิวไคลด์ที่ไม่มีกัมมันตภาพรังสี จึงสามารถตรวจจับ DNA หรือ RNA เป้าหมายได้ผ่านการถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติหรือโดยระบบไบโอติน-อะวิดินเนื่องจากจีโนมของไวรัสส่วนใหญ่ได้รับการโคลนและจัดลำดับ จึงสามารถตรวจพบได้โดยใช้ลำดับเฉพาะของไวรัสเป็นตัวตรวจสอบในตัวอย่างในปัจจุบัน วิธีการไฮบริไดเซชันประกอบด้วย: dot blot , in situ hybridization in cell , DNA blotting(DNA) (Southern blot) และ RNA blotting(RNA) (Northern blot)

บี.พีซีอาร์ เทคโนโลยี

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ได้มีการพัฒนาเทคนิคการขยายกรดนิวคลีอิกในหลอดทดลองโดยใช้ PCR เพื่อทดสอบไวรัสที่ไม่ไวต่อการกระตุ้นหรือไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้PCR เป็นวิธีการที่สามารถสังเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอจำเพาะโดยปฏิกิริยาโพลีเมอเรสในหลอดทดลองกระบวนการของ PCR ประกอบด้วยวัฏจักรความร้อนสามขั้นตอน: การทำให้เสียสภาพ การหลอม และการขยาย ที่อุณหภูมิสูง (93 ℃~95 ℃) DNA แบบสองเกลียวจะถูกแยกออกเป็นสองสายดีเอ็นเอเดี่ยวจากนั้นที่อุณหภูมิต่ำ (37 ℃~60 ℃) ไพรเมอร์นิวคลีโอไทด์ที่สังเคราะห์สองชนิดหลอมรวมกับส่วนดีเอ็นเอเสริมในขณะที่อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอนไซม์ Taq (72 ℃) การสังเคราะห์สาย DNA ใหม่เริ่มต้นจากไพรเมอร์ 3'end โดยใช้ DNA เสริมเป็นแม่แบบและนิวคลีโอไทด์เดี่ยวเป็นวัสดุดังนั้นหลังจากแต่ละวัฏจักร DNA หนึ่งสายสามารถถูกขยายออกเป็นสองสายเมื่อทำซ้ำขั้นตอนนี้ สาย DNA แต่ละสายที่สังเคราะห์ในรอบเดียวสามารถใช้เป็นแม่แบบในรอบถัดไป และจำนวนของสายโซ่ DNA จะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ ซึ่งหมายความว่าการผลิต PCR จะเพิ่มขึ้นในความเร็วบันทึก 2nหลังจากผ่านไป 25 ถึง 30 รอบ การผลิต PCR จะถูกระบุผ่านอิเล็กโตรโฟรีซิส และสามารถสังเกตผลิตภัณฑ์ DNA เฉพาะภายใต้แสงยูวี (254 นาโนเมตร)เพื่อประโยชน์ในด้านความจำเพาะ ความอ่อนไหว และความสะดวก PCR จึงถูกนำมาใช้ในการวินิจฉัยทางคลินิกของการติดเชื้อไวรัสหลายชนิด เช่น HCV, HIV, CMV และ HPVเนื่องจาก PCR นั้นไวมาก จึงสามารถตรวจจับ DNA ของไวรัสที่ระดับ fg ได้ การดำเนินการควรดำเนินการอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงผลบวกที่ผิดพลาดนอกจากนี้ ผลการทดสอบกรดนิวคลีอิกที่เป็นบวกไม่ได้หมายความว่ามีไวรัสติดเชื้ออยู่ในตัวอย่าง

ด้วยการประยุกต์ใช้เทคนิค PCR อย่างกว้างขวาง เทคนิคและวิธีการใหม่ ๆ ได้รับการพัฒนาโดยใช้เทคนิค PCR เพื่อวัตถุประสงค์ในการทดสอบที่แตกต่างกันตัวอย่างเช่น PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์สามารถตรวจจับปริมาณไวรัสได้in situ PCR ใช้เพื่อระบุการติดเชื้อไวรัสในเนื้อเยื่อหรือเซลล์PCR ที่ซ้อนกันสามารถเพิ่มความจำเพาะของ PCRในหมู่พวกเขา PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ได้รับการพัฒนาอย่างรวดเร็วยิ่งขึ้นเทคนิคใหม่หลายอย่าง เช่น โพรบไฮโดรไลซิส TaqMan, โพรบไฮบริไดเซชัน และโพรบบีคอนโมเลกุล ถูกนำมารวมกันเป็นเทคนิค PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยทางคลินิกนอกจากการระบุปริมาณไวรัสในของเหลวในร่างกายของผู้ป่วยอย่างถูกต้องแล้ว วิธีนี้ยังสามารถใช้เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ทนต่อยาได้อีกด้วยดังนั้น PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์จึงถูกนำมาใช้เป็นหลักในการประเมินผลการรักษาและการเฝ้าระวังความทนทานต่อยา

C. การตรวจหาปริมาณกรดนิวคลีอิกของไวรัสในปริมาณมาก

เพื่อตอบสนองความต้องการในการวินิจฉัยโรคติดเชื้ออุบัติใหม่อย่างรวดเร็ว จึงได้มีการกำหนดวิธีการตรวจหาปริมาณงานสูงต่างๆ เช่น ชิปดีเอ็นเอ (DNA)สำหรับชิป DNA โพรบเฉพาะจะถูกสังเคราะห์และยึดติดกับชิปซิลิกอนขนาดเล็กที่มีความหนาแน่นสูงมากเพื่อสร้าง DNA probe microarray (DNA) ซึ่งสามารถผสมพันธุ์กับตัวอย่างได้สัญญาณของการผสมพันธุ์สามารถถ่ายภาพได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลหรือเครื่องสแกนเลเซอร์ และประมวลผลเพิ่มเติมโดยคอมพิวเตอร์และสามารถรับชุดข้อมูลขนาดใหญ่เกี่ยวกับยีนที่แตกต่างกันได้DNA Chip มี 2 ชนิด“ชิปสังเคราะห์” มีดังต่อไปนี้: โอลิโกนิวคลีโอไทด์จำเพาะถูกสังเคราะห์โดยตรงบนชิปอีกอย่างคือชิป DNA poolยีนโคลนหรือผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกพิมพ์อย่างเป็นระเบียบบนสไลด์ข้อดีของเทคโนโลยีชิปดีเอ็นเอคือการตรวจจับลำดับดีเอ็นเอจำนวนมากพร้อมกันชิปตรวจจับเชื้อโรครุ่นล่าสุดสามารถระบุไวรัสในมนุษย์ได้มากกว่า 1,700 ตัวในคราวเดียวเทคโนโลยีชิปดีเอ็นเอช่วยแก้ปัญหาของวิธีการผสมกรดนิวคลีอิกแบบเดิมๆ และมีการใช้งานอย่างกว้างขวางในการวินิจฉัยไวรัสและการศึกษาทางระบาดวิทยา